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AxyPrep 基因組DNA小量試劑盒
本試劑盒采用獨(dú)特的裂解和相分離技術(shù)，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到純化基因組 DNA 的目的。每次制備可獲得多至20 μg 的基因組DNA。用于PCR、Southern 印跡分析、RAPD、RFLD 等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
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本試劑盒采用獨(dú)特的裂解和相分離技術(shù)，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到純化基因組 DNA 的目的。每次制備可獲得多至20 μg 的基因組DNA。用于PCR、Southern 印跡分析、RAPD、RFLD 等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
RNase A：50 mg/ml，室溫保存。
Buffer G-A：裂解液，室溫密閉貯存。
Buffer G-B：蛋白去除液，室溫密閉貯存。
Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液，請(qǐng)參照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存。
Buffer DV：相分離液，室溫密閉貯存。
Buffer BV：DNA 結(jié)合液，室溫密閉貯存。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇，混合均勻，室溫密
閉貯存。可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。
二、注意事項(xiàng)
Buffer G-A、Buffer G-B、Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，
避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量水沖洗，必要時(shí)尋
求醫(yī)療咨詢。
三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 第一次使用時(shí)，在Buffer W2 concentrate 中按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇并混合均勻。
2. 制備Buffer DV：取2 ml Buffer DV-A，125 ml 異丙醇，75 ml 異丁醇，加入提供的250 ml 試劑瓶
中，混合均勻。
3. 4℃預(yù)冷Buffer DV。
4. 準(zhǔn)備65℃水浴。
5. 使用前檢查Buffer G-A 和Buffer G-B 是否有沉淀析出，若出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于65℃水浴加熱至沉淀完
全溶解后再使用。
6. 將Eluent 或去離子水加熱至65℃有利于基因組DNA 的充分洗脫。
四、操作步驟
從樣品中提取基因組DNA
不同的樣品采用不同的勻漿步驟。
【從動(dòng)物組織中提取基因組DNA】
步驟1-3 請(qǐng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件選擇對(duì)應(yīng)的操作
使用研缽進(jìn)行勻漿
1. 取1-20 mg 動(dòng)物或人組織，移入冰水浴預(yù)冷的研缽中，快速、用力研磨成勻漿。
* 列組織請(qǐng)加液氮研磨至粉末狀后，將研缽置于65℃水浴，當(dāng)粉末開始融化時(shí)繼續(xù)研磨1 min，勻漿后加入650 μl
Buffer G-A 和0.9 μl RNase A，再進(jìn)入步驟3 的操作下。
A. 富含DNA 酶的胰臟，脾臟，胸腺，淋巴等組織。
B. 富含膠原蛋白的皮膚、肌健等組織。
C. 富含角質(zhì)蛋白的組織或堅(jiān)硬的組織如骨骼等。
2. 加入650 μl Buffer G-A 和0.9 μl RNase A 后溫和地研磨30 s。
3. 收集650 μl 研磨好的組織勻漿并轉(zhuǎn)入2 ml 離心管。如勻漿體積不足650 μl，補(bǔ)充Buffer G-A 至650 μl，65℃水浴5 min。
【從植物組織中提取基因組DNA】
1.按下表稱取適量的新鮮植物組織（如選用的是冷凍干燥的組織，則組織用量減半）。剪成小塊放入研缽中；如從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取基因組DNA，收集2×103-1×107 培養(yǎng)的植物細(xì)胞，10,000×g 離心1 min，加入150 μl 水充分懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)入研缽中，加入液氮，使組織冷凍完全后，快速、用力研磨至粉末狀。研磨時(shí)應(yīng)間斷加入液氮以防止組織融化，研磨充分后將研缽放入65℃水浴至樣品粉末剛開始融化。
* 表1 新鮮植物樣品使用量按下表收集
植物花或葉片 10-100 mg
植物莖 ≤240 mg
植物根 ≤240 mg
植物種子 ≤240 mg
* 如新鮮植物葉超過(guò)120 mg 或干植物葉超過(guò)60 mg，加入1300 μl Buffer G-A，勻漿后將樣品分到兩個(gè)2 ml 離心管中，然后按照步驟1-7 平行操作兩管，第8 步和接下來(lái)的步驟合并到一管操作，以提高洗脫的DNA 的濃度。
* 樣品研磨應(yīng)充分，否則嚴(yán)重影響基因組DNA 的得率。
2. 加入700 μl Buffer G-A 和1.2 μl RNase A 貯存液，用力碾磨30 s。
3. 轉(zhuǎn)移650 μl 研磨好的勻漿至2 ml離心管中，如勻漿體積不足650 μl,補(bǔ)充Buffer G-A 至650 μl，65℃水浴15 min。
* 富含纖維的根/莖等組織或富含淀粉、蛋白質(zhì)的種子等樣品，可延長(zhǎng)水浴時(shí)間至60 min。
【從培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】
步驟1-2 應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類型來(lái)操作，若從植物細(xì)胞中提取基因組DNA，請(qǐng)按步驟(從植物組織中提取基因組DNA)來(lái)勻漿
A. 懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞或新鮮分離的動(dòng)物組織單細(xì)胞懸液
1A. 用2 ml 離心管收集1×103-2×106 細(xì)胞懸浮液，2,000×g 離心5 min，棄盡上清。
2A. 加入150 μl 去離子水或PBS 懸浮細(xì)胞，加入500 μl Buffer G-A。
1B. 盡可能的丟掉上清液，加650 μl Buffer G-A 到每孔中，室溫靜置1 min。
2B. 用吸頭來(lái)回吸注幾次，轉(zhuǎn)移650 μl 勻漿至2 ml 離心管，如勻漿體積不足650 μl，補(bǔ)足Buffer G-A 至650 μl。加入0.8 μl RNase A,旋渦振蕩15 s，室溫靜置1 min。
【從酵母中提取基因組DNA】
1. 收集2×106-5×107 酵母細(xì)胞，10,000×g 離心 1min。用150 μl 水懸浮酵母細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至研缽中，加入液氮，待樣品被完全冷凍后，快速、用力研磨至粉末狀。將研缽放入65℃水浴至樣品粉末剛開始融化時(shí)進(jìn)入下一步操作。
* 當(dāng)OD680 為1 時(shí)，酵母濃度為3×107 細(xì)胞/ml。
* 酵母細(xì)胞壁較為堅(jiān)韌，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)研磨時(shí)間和研磨次數(shù)以確保充分破碎酵母細(xì)胞壁。
* 研磨時(shí)應(yīng)及時(shí)加入液氮，防止樣品在研磨時(shí)融化。
2. 加入600 μl Buffer G-A 和1.2 μl RNase A 貯存液，快速用力碾磨30 s。
3. 轉(zhuǎn)移650 μl 研磨好的勻漿至2 ml 離心管中，如勻漿體積不足650 μl，補(bǔ)充Buffer G-A 至650 μl，65℃水浴10 min。
【兩相分離去除蛋白和其它雜質(zhì)】
4. 加入400 μl Buffer G-B 和1 ml Buffer DV（4℃預(yù)冷），用力混合均勻。12,000×g 離心2 min。
* 請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前按照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備步驟2 準(zhǔn)備Buffer DV.
5. 盡可能丟棄上相，保留相間沉淀和下相。加入1 ml 4℃預(yù)冷Buffer DV，用力混合，12,000×g 離心2 min。
【基因組DNA 的純化】
6. 丟棄上相，將下相轉(zhuǎn)移至濾器（濾器置于2 ml 離心管中），12,000×g 離心1 min。
* 上相無(wú)需完全棄盡，在轉(zhuǎn)移無(wú)色下相時(shí)偶有混入的上相，可在Tip 頭內(nèi)迅速分相，便于丟棄。
* 如在轉(zhuǎn)移過(guò)程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可過(guò)濾除去。
* 有色上相務(wù)必除盡，否則將抑制DNA 結(jié)合到silica 膜上。
7. 棄濾器，在濾液中加入400 μl Buffer BV，混合均勻。
步驟8-11，可選擇離心法或負(fù)壓法
A．負(fù)壓法
8A. 將DNA 制備管插到負(fù)壓裝置的插口上，將步驟7 的混合液移到制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置至-20-30 英寸汞柱。
9A. 保持負(fù)壓，加入500 μl Buffer W1,吸盡管中液體。
10A. 保持負(fù)壓，加入700 μl 已加入乙醇的Buffer W2，吸盡管中液體；已同樣的方法再用700 μlBuffer W2 洗滌一次。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無(wú)水乙醇。
* 沿管壁加入Buffer W2 有助于徹底沖洗附在管壁上的鹽分。
* 兩次用Buffer W2 沖洗能確保鹽分被完全消除，消除對(duì)酶切反應(yīng)的影響。
11A. 將DNA 制備管放回2 ml 離心管中，12,000×g 離心1 min。
B．離心法
8B. 將DNA 制備管置于2 ml 離心管中，將步驟7 中的混合液移至制備管中，12,000×g 離心1 min。
9B. 棄濾液，將制備管置回到原來(lái)的2 ml 離心管中，加入500 μl Buffer W1，12,000×g離心1 min。
10B. 棄濾液，將制備管置回到原來(lái)的2 ml 離心管中，加入700 μl Buffer W2，12,000×g 離心1 min，以同樣的方法，用700 μl Buffer W2 再洗滌一次。
* 確認(rèn)Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上指定的體積加入無(wú)水乙醇。
* 再次用Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對(duì)酶切反應(yīng)的影響。
11B. 棄濾液，將制備管置回原來(lái)的2 ml 離心管中，12,000×g 離心1 min。
12. 將DNA 制備管置于另一潔凈的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加100-200 μl Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min，12,000×g 離心1min 洗脫DNA。
* 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。